Điều chế các biểu hiện gen để đồng hóa chất dinh dưỡng và chức năng miễn dịch ở tôm thẻ chân trắng Thái Bình Dương (Litopenaeus Vannamei) được nuôi trong các ao được xử lý bằng axit silicic khả dụng sinh học.

Của Tiến sĩ Noratat Prachom, Viện Công nghệ King Mongkut của Ladkrabang (KMITL), Thái Lan; PGS. GS Sasimanas Unajak, Khoa Hóa sinh, Đại học Kasetsart, Thái Lan; Giáo sư Tiến sĩ Simon J. Davies, Đại học Harper Adams, Vương quốc Anh và Tiến sĩ Henk-Maarten Laane, Rexil Agro BV, Hà Lan

 

Hiệu quả của việc sử dụng axit silicic khả dụng sinh học đối với các gen quan trọng được lựa chọn liên quan đến việc sử dụng chất dinh dưỡng, hiệu suất thức ăn và hệ thống miễn dịch của tôm thẻ chân trắng Thái Bình Dương, tôm thẻ chân trắng Litopenaeus vannamei được đánh giá sau thời gian nuôi thương phẩm là 56 ngày.

Người ta phát hiện ra rằng axit silicic khả dụng sinh học đã sửa đổi một số gen có thể tăng cường tiêu hóa, thúc đẩy sự đáp ứng tăng trưởng và tăng khả năng kháng bệnh cho tôm.

Các gen ảnh hưởng đến việc sử dụng thức ăn và khả năng chịu miễn dịch là amylase, trypsin, protein sốc nhiệt 60, protein sốc nhiệt 70 và lectin loại C (CTL’s). Đối với các thông số chức năng miễn dịch cụ thể, các biểu hiện gen cho các yếu tố crushtin, chống lipopolysaccharide, penaeidin-3 đều được xác định chống lại Β-actin (gen chính).

Người ta chỉ ra rằng các gen liên quan đến hệ tiêu hóa nội sinh sản xuất enzyme được điều chỉnh thấp (trypsin & amylase) cho thấy nhu cầu tiêu hóa giảm để sản xuất enzyme.

Người ta cũng quan sát thấy rằng gen của HSP 60 được điều chỉnh tăng một chút nhưng đối với HSP 70 được điều chỉnh giảm đáng kể. Điều đó cũng được quan sát thấy đối với gen CTL ở tôm thẻ chân trắng tiếp xúc với axit silicic.

Các gen quan trọng đối với khả năng miễn dịch dựa trên tế bào ở tôm chủ yếu được điều chỉnh ở mức độ khác nhau với penaeidin đặc biệt được kích thích. Phản ứng của những thay đổi này được phản ánh trong việc cải thiện hiệu suất và sử dụng chất dinh dưỡng của L. vannamei trong điều kiện nuôi thương phẩm trong ao.

Thúc đẩy các điều kiện tối ưu cho nuôi tôm

Ngành tôm hiện nay là một ngành nuôi trồng thủy sản đang mở rộng, đóng góp quan trọng vào nguồn cung cấp thủy sản toàn cầu, đạt giá trị 39,24 tỷ đô la Mỹ vào năm 2019, dự kiến đạt 54,6 tỷ đô la Mỹ vào năm 2027, với tốc độ CAGR 9,2% từ 2022 đến 2027 (Báo cáo tình báo Mordor, năm 2022). Sản lượng này phụ thuộc vào nguồn thức ăn chất lượng cao mà còn sử dụng nguồn nước bền vững và các điều kiện môi trường ổn định để hiệu suất tối ưu và điều kiện chăn nuôi khỏe mạnh.

Trong thực hành nuôi trồng thủy sản, người ta nhận thấy rằng một lĩnh vực cần được xem xét là việc sử dụng các biện pháp dự phòng liên quan đến các hợp chất sinh học và khoáng chất tự nhiên có thể làm tăng thêm và ổn định môi trường nước, thúc đẩy tối ưu điều kiện nuôi tôm.

Các loại đất sét và kim loại đất khác nhau có các đặc tính riêng biệt và silicon là một trong những nguyên tố như vậy. Tầm quan trọng của khả dụng sinh học silic như axit silicic đã được báo cáo bởi Laane (2013). Đây là nguyên tố đóng một vai trò quan trọng trong quá trình trao đổi chất hệ thống và được liên kết với sự sinh tổng hợp các mô liên kết ở nhiều loài và ở hệ thống miễn dịch chung để duy trì sự bảo vệ dựa trên tế bào liên quan đến nhiều protein điều hòa và các phân tử tín hiệu (Martin, 2013).

Ở tôm đang phát triển nhanh, nhiều gen cũng liên kết với sự đồng hóa và tăng trưởng chất dinh dưỡng như đồng hóa sự trao đổi chất cũng như các gen chính điều chỉnh hệ chức năng miễn dịch. Các gen như trypsin và amylase có liên quan đến tiêu hóa và sẽ được điều chỉnh lên hoặc điều chỉnh xuống tùy theo nhu cầu. Protein sốc nhiệt 60, protein sốc nhiệt 70, và CTL (lectin loại C) có mối liên hệ với sự nhận biết mầm bệnh, chống chịu và hỗ trợ miễn dịch ở tôm (Chaurasia 2016; Wang và cộng sự. Năm 2020).

Crustins là các protein nhỏ mang điện tích dương cụ thể được giả định là tác dụng kháng khuẩn chống lại chủ yếu là vi khuẩn gram dương nhất và được tìm thấy trong côn trùng và động vật giáp xác. Tuy nhiên, tương đối ít crustins đã được điều tra kỹ lưỡng và đặc biệt ở tôm. Ở P. leniusculus Plcustin1 tái tổ hợp và 2 cả hai thể hiện các hoạt động diệt khuẩn đối với vi khuẩn gram dương nhất. (Donpudsa và cộng sự, 2010).

Các giao thức sinh học phân tử

1. Sự tách chiết RNA

Gan tụy được chiết xuất bằng cách sử dụng thuốc thử trizol (Invitrogen, Hoa Kỳ). Trong một thời gian ngắn, 1 ml thuốc thử trizol đã được thêm vào thành 50 – 100 mg mẫu mô. Sau đó là các mẫu được đồng nhất ở tốc độ 3.500 vòng / phút trong 1 phút bằng cách sử dụng Micro Smash MS-100R (TOMY, Nhật Bản). Sau khi ủ mẫu trong phòng nhiệt độ trong 5 phút, 200 µl cloroform được thêm vào và trộn mạnh. Các mẫu sau đó được ly tâm với tốc độ 12.000 vòng / phút tại 4 ° C trong 15 phút. Sau đó phần nổi phía trên được gạn sang ống mới 1,5 ml, một thể tích isopropanol đã được thêm vào và ủ ở -20 ° C trong 2 giờ. Tiếp theo, các viên RNA được thu thập bằng cách ly tâm ở 12.000 vòng / phút ở 4 ° C trong 15 phút. Sau đó, các viên được rửa bằng 500 µl etanol 75% và viên khô ở 65 ° C. Cuối cùng, 30 µl nước không có RNase đã được thêm vào để phân giải các viên RNA. Nồng độ RNA là được đo bằng cách sử dụng máy quang phổ nhỏ giọt nano (Thermo Fisher Khoa học, Hoa Kỳ).

 

2. Khai thác và xử lý DNase

Sau khi tách chiết RNA, DNA được loại bỏ bằng cách sử dụng DNase I (Thermo Fisher Scientific, Hoa Kỳ). Phản ứng xử lý DNase I bao gồm 1 µl đệm 10X, 1 µl DNase I và 1 – 2 µg RNA. Sau đó, thể tích được điều chỉnh thành 10 µl bằng cách sử dụng nước không có RNase . Sau khi chuẩn bị xong phản ứng, hỗn hợp được ủ ở 37 ° C trong 30 phút và sau đó thêm 1 µl EDTA và ủ ở 65 ° C trong 10 phút để dừng phản ứng.

3. Chuẩn bị cDNA

cDNA trong thí nghiệm này được chuẩn bị bằng cách sử dụng kit RT-PCR 2 bước của Viva (Vivantis, Malaysia). Đầu tiên, 1 ug RNA được xử lý DNase, 1 µl mồi oligo dT và 1 µl 10 mM dNTP được thêm vào ống 0,2 ml và ủ ở 65 ° C trong 5 phút.

Sau khi được làm lạnh nhanh trên đá, 2 µl đệm 10X và 100 U của men sao chép ngược M MuLV được thêm vào và điều chỉnh thể tích thành 20 µl với nước không có RNase. Tiếp theo, các hỗn hợp được ủ ở 42 ° C trong 90 phút và sau đó ủ ở 85 ° C trong 5 phút để dừng phản ứng.

4. Thời gian thực của chuỗi phản ứng polymerase (PCR)

Trong nghiên cứu này, 2x qPCRBIO SyGreen Mix Lo-ROX (PCRBIOSYSTEM, UK) đã được sử dụng để phát hiện các gen tăng trưởng và các gen liên quan đến miễn dịch ở tôm. Các đoạn mồi được sử dụng được hiển thị trong Bảng 1.

Phản ứng thời gian thực của PCR bao gồm 1 µl trong số 100 cDNA, 5 µl hỗn hợp 2x q PCRBIO SyGreen, chuyển tiếp và mồi ngược ở nồng độ cuối cùng 0,2 µM và được điều chỉnh thể tích lên đến 10 µl bằng cách sử dụng nước không có nuclease. Điều kiện thời gian thực ban đầu của PCR là từ giai đoạn biến tính ở 95 ° C trong 5 phút, sau đó là giai đoạn biến tính ở 95 ° C trong 30 giây, ủ ở 58 ° C trong 30 giây. Tiếp theo là 40 chu kỳ lặp lại và kéo dài lần cuối ở 72 ° C trong 5 phút.

Mức độ biểu hiện gen gấp tương đối được tính bằng cách sử dụng công thức dưới đây.

Mức độ biểu hiện gen gấp tương đối = 2-∆∆CT

CT = Số chu kỳ của mẫu

∆CT = CT (gene of interest) – CT (housekeeping gene)

∆∆CT = ∆CT (mẫu đã xử lý) – ∆CT (mẫu chưa xử lý)

Cơ chế phòng thủ chính

Tôm hoạt động tốt hơn đáng kể khi tiếp xúc với axit silicic có sẵn trong 8 tuần trong điều kiện nuôi ao được sử dụng. Kết quả về tăng trưởng và năng suất thức ăn của tôm đối với các nghiệm thức thí nghiệm được trình bày trong Bảng 2.

Những điều này cho thấy sự nâng cao rất đáng kể trong tổng sinh khối và trọng lượng cơ thể trung bình của động vật vào cuối giai đoạn thử nghiệm (trung bình trọng lượng của đối chứng 9,48 và 12,49 đối với sản phẩm axit silicic) hiển thị như trong Hình 1.

SGR (Tỷ lệ tăng trưởng cụ thể) được định nghĩa là mức tăng trọng lượng sống trung bình hàng ngày (% ngày -1) cũng phản ánh hiệu quả cao hơn nhiều và có ý nghĩa của việc bổ sung axit silicic vào ao nuôi. Tỷ lệ hiệu quả protein (PER) là phép đo mức độ tăng sinh khối trên một đơn vị lượng protein ăn vào và phản ánh hiệu quả chuyển đổi của quá trình chuyển đổi protein trong khẩu phần tính theo tổng.

Rõ ràng là từ Bảng 1 có sự gia tăng đáng kể PER cho thấy rằng axit silicic đã tăng cường chuyển đổi protein từ 1,42 lên 1,76. Mức độ sống sót của L. Vannamei tăng 11,5% và được coi là đáng kể. Mục đích chính của nghiên cứu này là xác định ảnh hưởng của axit silicic đối với sự biểu hiện gen và liên kết với hiệu suất.

SGR (Tỷ lệ tăng trưởng cụ thể) được định nghĩa là mức tăng trọng lượng sống trung bình hàng ngày (% ngày -1) cũng phản ánh hiệu quả cao hơn nhiều và có ý nghĩa của việc bổ sung axit silicic vào ao nuôi. Tỷ lệ hiệu quả protein (PER) là phép đo mức độ tăng sinh khối trên một đơn vị lượng protein ăn vào và phản ánh hiệu quả chuyển đổi của quá trình chuyển đổi protein trong khẩu phần tính theo tổng.

Rõ ràng là từ Bảng 1 có sự gia tăng đáng kể PER cho thấy rằng axit silicic đã tăng cường chuyển đổi protein từ 1,42 lên 1,76. Tỷ lệ sống của L. Vannamei tăng 11,5% và được coi là đáng kể. Mục đích chính của nghiên cứu này là xác định ảnh hưởng của axit silicic đối với sự biểu hiện gen và liên kết với hiệu suất.

Do đó, do tầm quan trọng được biết đến của các gen điều hòa trong việc kiểm soát sự đồng hóa protein và năng lượng cũng như chức năng miễn dịch, nhiều gen khác nhau đã được lựa chọn phù hợp với tầm quan trọng của chúng đối với các tính trạng sản xuất của tôm được trình bày như trong Bảng 2. Để so sánh sự khác biệt giữa tôm đối chứng và tôm xử lý, thời gian thực PCR được thực hiện bằng cách sử dụng 6 gen bao gồm α – amylase và trypsin; protein sốc nhiệt 60, protein sốc nhiệt 70, chitin và lectin loại C (CTLs). Kết quả chứng minh rằng trong trường hợp biểu hiện gen α – amylase, CTLs và trypsin, có sự khác biệt đáng kể giữa nhóm đối chứng và nhóm điều trị (Hình 2).

Việc điều tiết giảm của hai gen mã hóa cụ thể sản xuất amylase (phân giải tinh bột) và trypsin (phân hủy protein) có thể ngụ ý một hành động tiết kiệm do tác động tăng cường của axit silicic đối với sản xuất sơ cấp của các sinh vật phù du trong ao.

Axit silicic khả dụng sinh học đã được chứng minh khả năng cung cấp silic như một chất dinh dưỡng quan trọng cho tảo cát và đời sống thực vật và gián tiếp động vật phù du cung cấp các enzym tiêu hóa ngoại sinh tự nhiên cho tôm làm giảm nhu cầu sinh tổng hợp và nhu cầu năng lượng. Sự hỗ trợ tiêu hóa như vậy sẽ đòi hỏi sản xuất enzyme đường ruột nội sinh ít hơn nhiều, dẫn đến tăng hiệu quả sử dụng và hiệu quả thức ăn.

Xem xét tầm quan trọng của protein sốc nhiệt (HSP) trong hệ thống miễn dịch bẩm sinh của tôm, một phương pháp tiếp cận phân tử so sánh đã được đề xuất để nghiên cứu các HSP lớn 60, 70 và 90 của giáp xác và được thực hiện bởi Chaurasia và cộng sự (2016). Ba HSP lớn khác nhau đã được xác định từ cDNA của tôm càng xanh Macrobrachium rosenbergii (Mr) trong quá trình sàng lọc trong nghiên cứu này.

Các tính năng đặc trưng về cấu trúc và chức năng của HSP đã được nghiên cứu bằng cách sử dụng các công cụ tin sinh học khác nhau. Ngoài ra, sự biểu hiện gen và quy định mRNA của họ được xác định bởi những công nhân này. Protein sốc nhiệt 60 và 70 cũng được tìm thấy ở L. Vannamei thể hiện các chức năng liên quan đến hệ miễn dịch tương tự. Quá trình điều tiết giảm của protein sốc nhiệt 60 ở tôm chịu axit silicic là rất thú vị.

Điều này có thể liên quan đến việc tôm có khả năng ít căng thẳng hơn về tình trạng sinh lý và tăng khả năng chống chịu với các điều kiện môi trường. HSP60 ở tôm thẻ chân trắng đã được suy đoán để điều chỉnh các phản ứng thích nghi để vượt qua các áp lực môi trường theo báo cáo của Huang và cộng sự (2011).

Các tác giả này đã chứng minh rằng HSP60 đóng một vai trò quan trọng trong hệ thống miễn dịch nội tại và phản ứng căng thẳng toàn thân của tôm.

Việc giảm kích hoạt gen này do tiếp xúc với axit silicic là một xác nhận thú vị về một viễn cảnh tiềm năng giảm bớt căng thẳng.

Ngoài ra, lectin loại C (CTLs) là protein nhận dạng chính trong khả năng miễn dịch của tôm. Wang và cộng sự (2020) đã xem xét thông tin trình tự, tính đặc hiệu của phối tử, cấu hình biểu hiện và các chức năng cụ thể của CTL của tôm.

Lectin loại C đóng vai trò quan trọng trong các tương tác mầm bệnh ở tôm. Hơn nữa, gen liên quan đến miễn dịch (crushtin, Yếu tố chống Lipopolysaccharide (ALF) và penaeidin-3 (PEN3)) đã được thử nghiệm trong thử nghiệm này và có sự khác biệt đáng kể trong các thuật ngữ biểu hiện đối với nhóm tôm đối chứng đã trình bày ở trong Hình 3.

Kết quả cho thấy tất cả các gen miễn dịch cụ thể của tôm nhóm xử lý axit silicic đều có mức độ biểu hiện gen gấp tương đối cao hơn so với nhóm đối chứng.

Do đó, các gen crustin, ALF-1 và peneaidin-3 dường như được điều chỉnh khi tôm tiếp xúc với việc bổ sung axit silicic vào ao nuôi. Điều này đặt ra những ý nghĩa thú vị cho các cơ chế phòng thủ của tôm và hệ thống miễn dịch bẩm sinh.

Crustin là kháng khuẩn peptide (AMP) đóng vai trò quan trọng trong khả năng miễn dịch bẩm sinh của động vật giáp xác – Sun và cộng sự (2017). Sự điều chỉnh gen có thể biểu thị sự chuẩn bị nâng cao để giảm thiểu sự chấn thương mầm bệnh và chống lại bệnh tật ở tôm và có liên quan chặt chẽ đến tình trạng môi trường. Các gen giống như crushtin chủ yếu được biểu hiện ở mang tôm và biểu hiện quá mức trong các tế bào máu của tôm sau khi tiếp xúc với WSSV hoặc Vibrio alginolyticus.

Đây là những sinh vật gây bệnh phổ biến đối với tôm nuôi thâm canh trên toàn cầu. Crustin cũng được sản xuất trong gan-tụy của tôm và quan trọng trong việc duy trì một hệ thống tiêu hóa hoạt động. Thật vậy, công trình nghiên cứu gần đây của Li et al. (2019) chỉ ra rằng crushtin đóng một vai trò quan trọng trong khả năng miễn dịch bẩm sinh và có thể được sử dụng làm chất kháng khuẩn ở tôm.

Các yếu tố chống lipopolysaccharide (ALFs) là một tập hợp các phân tử tác động của khả năng miễn dịch bẩm sinh ở động vật chân đốt, thể hiện các hoạt động liên kết và trung hòa với lipopolysaccharide (được tìm thấy trên bề mặt của vi khuẩn). Chúng có vai trò tương tự đối với tôm như Litopenaeus vannamei như được mô tả bởi Zhan và cộng sự (2015) và chiếm một thành phần quan trọng trong hệ thống bẩm sinh của động vật giáp xác và đặc biệt là trong các giai đoạn thách thức chống lại bệnh thủy sản.

Các nghiên cứu sau đó cho thấy ALF là một nhóm các protein cơ bản nhỏ, được giải phóng vào hemolymph do sự phân hủy nhanh chóng của các tế bào huyết cầu để phản ứng với lipopolysaccharide của vi khuẩn (LPS) và cho thấy hoạt động kháng khuẩn mạnh mẽ chống lại các vi khuẩn gram âm loại thô.

Penaeidin là một nhóm các kháng khuẩn peptit được sản xuất và được lưu trữ trong hồng cầu của tôm penaeid. Đáp lại để kích thích vi sinh vật, chúng được giải phóng vào tuần hoàn hemolymph, và chúng tiếp tục bám chặt vào bề mặt biểu bì của tôm thông qua khả năng liên kết chitin.

Chúng là hàng rào phòng thủ chính và bảo vệ tôm ở bề mặt nơi vi khuẩn, vi rút và nấm sẽ được đặt ở một vị trí dễ bị tổn thương và đặc biệt là trong các giai đoạn đan xen khi bộ xương ngoài mai đang trải qua sự phát triển.

Tác động của việc điều chỉnh gen của penaeidin-3 như một chất chính phân tử phòng thủ do axit silicic là một phát hiện quan trọng của nghiên cứu này. Sự điều chỉnh nhẹ của crushtin và ALF-1 cũng được quan tâm.

Tác dụng của axit silicic khả dụng sinh học trong việc nâng cao hàng rào miễn dịch sẽ có liên quan trong các viễn cảnh sản xuất tôm thâm canh để giảm căng thẳng và giảm thiểu bùng phát mầm bệnh.

 

Bảng 1: Danh sách các gen được chọn để xác định thời gian thực PCR

 

Bảng 2. Hiệu suất tăng trưởng của tôm thẻ chân trắng Thái Bình Dương nuôi ở hai nồng độ axit silicic khác nhau

Các ký tự trên khác nhau trong cùng một hàng có nghĩa là khác nhau đáng kể (P <0,05)

 

Tối ưu hóa sức khỏe và  sản xuất tôm

Kết luận, hiệu quả của việc bổ sung sản phẩm axit silicic sinh học (REXAQUA®) có tác động rõ rệt đến các gen cụ thể ảnh hưởng đến hiệu suất của tôm liên quan đến hiệu quả chức năng tiêu hóa và tăng cường các thành phần chính của hệ thống miễn dịch bẩm sinh và khả năng chịu stress của tôm.

Nghiên cứu tương tự tập trung vào tăng trưởng và chuyển đổi thức ăn cũng như hiệu quả sử dụng protein phù hợp với nghiên cứu này về dinh dưỡng và tiềm năng miễn dịch nói chung. Thực tế là axit silicic khả dụng sinh học có thể nâng cao đáng kể chất lượng nước và điều kiện môi trường cũng như thúc đẩy sự phát triển của sinh vật phù du bao gồm sản xuất tảo cát để tạo ra một biofloc ổn định là ẩn chứa trong những phát hiện này.

Công việc trong tương lai phải được định hướng để đánh giá quá trình trao đổi chất quan trọng khác các gen liên quan và để khám phá sự tham gia của chúng trong việc tối ưu hóa sức khoẻ và sản lượng của tôm trong các điều kiện khác nhau.

Tài liệu tham khảo có sẵn theo yêu cầu.